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一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工1 成果簡(jiǎn)介一步酶法從頭孢菌素 c（CPC） 生產(chǎn) 7－氨基頭孢烷酸（ 7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對(duì) CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國(guó)內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。2 技術(shù)指標(biāo)菌 種：基因工程大腸桿菌，卡那抗性，組成型表達(dá)。 發(fā)酵溫度： 37℃ 培 養(yǎng) 基：普通的大腸桿菌培養(yǎng)基，主要成分有玉米漿等廉價(jià)的營(yíng)養(yǎng)源。 發(fā)酵周期： 20 小時(shí) 發(fā)酵酶活： 3U/ml 以上（ 5 升發(fā)酵罐） 特 點(diǎn)：遺傳特性穩(wěn)定，不需要添加誘導(dǎo)劑和抗生素，工藝簡(jiǎn)單。3 合作方式小試技術(shù)轉(zhuǎn)讓或合作進(jìn)行中試。4 所屬行業(yè)領(lǐng)域醫(yī)療衛(wèi)生。業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對(duì) CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國(guó)內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。

一步酶法從頭孢菌素c（ CPC） 生產(chǎn)7－氨基頭孢烷酸（7-ACA） 是繼我們研發(fā)的兩步酶法工藝成功應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)以后，在生產(chǎn)頭孢菌素類抗生素醫(yī)藥中間體技術(shù)的又一個(gè)突破。與化學(xué)法和兩步酶法相比，一步酶法有工藝簡(jiǎn)單、環(huán)保和轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)品質(zhì)量好等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)采用基因工程技術(shù)對(duì) CPC 酰化酶（一步酶法用酶）的基因進(jìn)行了改造，獲得了能夠高效催化 CPC 到 7-ACA 的突變基因。通過我們自己構(gòu)建的高效啟動(dòng)子 HP 以及優(yōu)化組合的調(diào)控表達(dá)元件，構(gòu)建并篩選出了能夠高效、高活性表達(dá)一步酶法用酶——CPC 酰化酶的基因工程細(xì)胞株。這是國(guó)內(nèi)第一個(gè)使得 CPC 酰化酶活性能夠達(dá)到工業(yè)應(yīng)用水平的技術(shù)。由于采用了高效的表達(dá)系統(tǒng)和穩(wěn)定的質(zhì)粒，以及組成型表達(dá)結(jié)構(gòu)，使得該基因工程菌遺傳特性非常穩(wěn)定，在發(fā)酵制酶的過程中不需要添加任何抗生素和誘導(dǎo)劑就可以實(shí)現(xiàn)高效、高活性表達(dá)。在高效表達(dá) CPC 酰化酶的基礎(chǔ)上，我們通過在表達(dá)基因上同時(shí)引入的特殊基因序列，使得蛋白的純化和固定化工藝一步進(jìn)行。通過自己開發(fā)研制的可重復(fù)使用的固定化載體，可以使得固定化酶活性達(dá)到 60U/g 以上。 采用我們研制的特異性純化介質(zhì)，可以從菌體破碎液中一步純化和固定化 CPC 酰化酶，酶收率在 90 ％以上，固定化酶活達(dá)到 60U/g 以上。固定化酶可以重復(fù)使用 20 批以上，純化和固定化用載體可以重復(fù)使用。

(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯用于合成多種血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)普利藥物，如貝 那普利、西拉普利等，該類藥物用于治療高血壓。在抗高血壓藥物市場(chǎng)中，ACEI與非肽類血 管緊張素II (AngII)受體抑制劑、鈣通道拮抗劑(CCB)形成了三足鼎立的市場(chǎng)格局。該類藥物 2009年的世界銷售為52億美元，國(guó)內(nèi)市場(chǎng)約30億元人民幣，國(guó)內(nèi)外對(duì)普利原料藥需求旺盛，價(jià) 格穩(wěn)定，尤其是貝那普利等緊俏產(chǎn)品，主要依賴進(jìn)口，國(guó)內(nèi)外前景樂觀。目前，我國(guó)在卡托普 利、依那普利、賴諾普利、雷米普利、喹那普利、貝那普利和福辛普利等8個(gè)普利藥物實(shí)現(xiàn)了 產(chǎn)業(yè)化。傳統(tǒng)的生產(chǎn)(R)-HPBE的方法為化學(xué)法，存在催化劑較昂貴且污染環(huán)境、產(chǎn)物光學(xué)活 性低、對(duì)設(shè)備壓力要求高等缺點(diǎn)，本項(xiàng)目采用的生物法，綠色無(wú)污染，催化劑成本低，產(chǎn)物光 學(xué)活性高，操作簡(jiǎn)單，條件溫和，具有很好的市場(chǎng)前景。 本項(xiàng)目開發(fā)了一種酶促不對(duì)稱還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯制備多種普利類藥物關(guān)鍵手性 中間體(R)-2-羥基-4-苯基丁酸乙酯的生物技術(shù)。該技術(shù)易于放大，反應(yīng)溫和(30℃，pH 6.0)，產(chǎn) 品光學(xué)純度高(>99%)，收率85%，且不需要添加昂貴的輔酶再生系統(tǒng)。項(xiàng)目的實(shí)施將節(jié)能減排 20-30%，生產(chǎn)成本降低20%以上，產(chǎn)品收率提高15%，顯示了該項(xiàng)技術(shù)具有很好的工業(yè)應(yīng)用前 景。

本技術(shù)成果公開了一種3-硝基-2H-色烯類化合物及其制備方法和用途。

本發(fā)明公開了一種斜生纖孔菌3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因及其編碼的蛋白質(zhì)與用途，本發(fā)明所提供的鯊烯合酶基因具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)核苷酸的同源序列或其等位基因及其衍生的核苷酸序列。所示基因編碼的蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列或者添加、取代、插入或缺失一個(gè)或多個(gè)氨基酸的同源序列。本發(fā)明提供的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶基因可以通過基因工程技術(shù)提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇的含量，可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)來(lái)提高斜生纖孔菌中樺褐孔菌醇含量的研究和產(chǎn)業(yè)化中。而這些次生代謝產(chǎn)物在臨床上具有巨大的應(yīng)用價(jià)值，對(duì)保護(hù)人民的健康生長(zhǎng)有所幫助。因而本發(fā)明具有很大的應(yīng)用前景。

包蟲病是由棘球絳蟲寄生于人體或宿主動(dòng)物而引起的嚴(yán)重寄生蟲疾病。而我國(guó)是同時(shí)有囊型和泡狀兩種類型的包蟲病高發(fā)區(qū)。目前臨床應(yīng)用最廣泛的抗包蟲病藥物是阿苯達(dá)唑，但是該藥的腸道吸收率很差，而且其一般只能抑制寄生蟲生長(zhǎng)而不能徹底有效殺滅寄生蟲，導(dǎo)致患者必須長(zhǎng)期大量服用該藥物才能達(dá)到治療效果。與此同時(shí)，大量的研究發(fā)現(xiàn)該藥可引起多系統(tǒng)的嚴(yán)重藥物不良反應(yīng)。因此，尋找或開發(fā)療效顯著且副作用小的包蟲病治療新藥物具有重大的意義。 棘球絳蟲獲取能量的主要方式通過糖酵解過程。而甘油醛 3-

南方科技大學(xué)生物系兼職教授、美國(guó)科學(xué)院院士鄧興旺聯(lián)合北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院副研究員朱丹萌課題組，揭示了HY5(ELONGATED HYPOCOTYL 5)在光下可通過蛋白-蛋白直接互作增強(qiáng)BIN2 （BRASSINOSTEROID-INSENSITIVE 2）的激酶活性，抑制幼苗下胚軸伸長(zhǎng)。相關(guān)論文以“Modulation of BIN2 kinase activity by HY5 controls hypocotyl elongation in the light”為題發(fā)表在《自然-通訊》（Nature Communications）上。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)了HY5調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)的新方式，揭示了其介導(dǎo)的BR信號(hào)抑制機(jī)理，為GSK3β激酶活性調(diào)控研究提供了新視角，或可為今后HY5蛋白的定向改造提供氨基酸位點(diǎn)信息。這項(xiàng)研究是研究團(tuán)隊(duì)繼發(fā)現(xiàn)光形態(tài)建成抑制因子COP1抑制BIN2活性來(lái)促進(jìn)暗形態(tài)建成的非經(jīng)典功能 (Ling et al., 2017, PNAS)之后的又一新發(fā)現(xiàn)，并再次揭示光信號(hào)途徑重要因子“技多不愁”的有趣現(xiàn)象。

本發(fā)明公開了一種基于聚丙烯酸鈉-陽(yáng)離子表面活性劑復(fù)合物滲透汽化優(yōu)先透醇膜的制備方法。首先制備聚丙烯酸鈉-陽(yáng)離子表面活性劑復(fù)合物，后將其溶解在有機(jī)溶劑中，采用溶液涂覆法制備均質(zhì)滲透汽化透醇膜。聚丙烯酸鈉-陽(yáng)離子表面活性劑復(fù)合物內(nèi)部的離子交聯(lián)結(jié)構(gòu)能夠有效抑制該均質(zhì)滲透汽化透醇膜在醇/水料液中溶脹，保持膜的穩(wěn)定性；同時(shí)，疏水長(zhǎng)鏈和聚電解質(zhì)的疏水主鏈，能提供膜對(duì)醇的優(yōu)先選擇吸附。通過調(diào)控聚丙烯酸鈉的分子量和離子化程度，表面活性劑的種類以及分子鏈結(jié)構(gòu)和聚集形態(tài)，能夠制備不同的復(fù)合物和復(fù)合物膜。采用本發(fā)明所用的方法可以大大提高滲透汽化膜的滲透性，且該類優(yōu)先透醇膜制膜方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉。

本發(fā)明公開了季銨鹽型陽(yáng)離子聚電解質(zhì)-陰離子表面活性劑復(fù)合物的制備方法及用途。首先采用溶液滴定絡(luò)合的方式制備季銨鹽型陽(yáng)離子聚電解質(zhì)-陰離子表面活性劑復(fù)合物，后將其溶解在有機(jī)溶劑中，將其涂覆在支撐層上，烘干得到季銨鹽型陽(yáng)離子聚電解質(zhì)-陰離子表面活性劑復(fù)合物滲透汽化優(yōu)先透醇膜。季銨鹽型陽(yáng)離子聚電解質(zhì)-陰離子表面活性劑復(fù)合物內(nèi)部的離子交聯(lián)結(jié)構(gòu)能夠有效抑制該滲透汽化透醇膜在醇/水料液中的過度溶脹，保持膜的穩(wěn)定性；同時(shí)，表面活性劑的疏水長(zhǎng)鏈和聚電解質(zhì)的疏水主鏈，能提供膜對(duì)醇的優(yōu)先選擇吸附。因此，該類優(yōu)先透醇膜制膜方法簡(jiǎn)單易行、成本低廉，具有良好的工業(yè)化應(yīng)用前景。

帕金森病是一種是老年人群中常見的慢性、進(jìn)行性、運(yùn)動(dòng)障礙性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病主要是由于大腦中缺乏多巴胺引起的．左旋多巴(Levodopa，L-dopa)為目前治療帕金森病的主要藥物．多巴胺不能夠通過血腦屏障到達(dá)大腦治療帕金森病，而 L-dopa 能夠通過血腦屏障，到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并在體內(nèi)脫羧酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槎喟桶罚瑥亩委熍两鹕。Ｒ姷闹委熍两鹕〉乃幬锒酁?L-dopa 及其與其他藥物的復(fù)合物，如美多芭、息寧等。在全球 500 強(qiáng)暢銷藥物市場(chǎng)中，抗帕金森治療市場(chǎng)超過 20 億美元。 來(lái)源于大腸桿菌的 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶（ p-hydroxyphenylacetate3-hydroxylase ，PHAH) 具有較寬的底物范圍，可以將 L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為 L-dopa，反應(yīng)單向進(jìn)行，產(chǎn)物均為 L 型，且該酶不會(huì)進(jìn)一步氧化 L-dopa。但由于 L-酪氨酸并不是 PHAH 的最適底物，該方法催化生成 L-dopa 反應(yīng)速率慢，到目前文獻(xiàn)報(bào)道的最高產(chǎn)率為 12.5g/L，并不能實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用。 前期本實(shí)驗(yàn)室通過對(duì)大腸桿菌芳香族氨基酸代謝途徑進(jìn)行改造，已獲得從葡萄糖發(fā)酵生成 L-酪氨酸高產(chǎn)大腸桿菌菌株，發(fā)酵水平僅次于美國(guó)麻省理工學(xué)院與美國(guó)杜邦合作文獻(xiàn)報(bào)道的 L-酪氨酸發(fā)酵水平.本課題對(duì) 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶進(jìn)行突變改造，獲得了一催化反應(yīng)速度大幅提升的突變體。在 L-酪氨酸的代謝途徑的基礎(chǔ)上，含 4-羥基苯乙酸-3-羥化酶突變體的大腸桿菌培養(yǎng) 38 小時(shí)轉(zhuǎn)化生成左旋多巴產(chǎn)率即可達(dá) 50g/L 以上，且培養(yǎng)發(fā)酵簡(jiǎn)單易行為世界上首個(gè)采用此法可實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)應(yīng)用的左旋多巴生產(chǎn)路線。目前左旋多巴市場(chǎng)價(jià)格約為50 萬(wàn)/噸，此法生產(chǎn)成本遠(yuǎn)低于左旋多巴市場(chǎng)價(jià)格。