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01.成果簡介 CRISPR/Cas9是細菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)。其工作原理是crRNA通過堿基配對與tracrRNA結(jié)合形成tracrRNA/crRNA復合物，此復合物引導核酸酶cas9蛋白在與crRNA配對的序列靶位點剪切雙鏈DNA。經(jīng)過研究，通過人工設(shè)計tracrRNA/crRNA，改造形成具有引導作用的sgRNA，可以引導Cas9蛋白在多種細胞的特定基因組位點上進行切割、修飾，并最終實現(xiàn)基因突變、插入或缺失。因此，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域。 近年來，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在真核生物和原核生物中得到了廣泛的應(yīng)用。在大腸桿菌等革蘭氏陰性菌中，用一個載體表達cas9基因，同時由于革蘭氏陰性菌重組效率低，需要在這個載體上表達λ-RED重組酶；在另一個載體中表達sgRNA和用于同源重組的同源臂序列。兩個載體都轉(zhuǎn)入大腸桿菌中時，sgRNA介導Cas9蛋白切割基因組上特定序列，形成雙鏈斷裂，刺激同源重組的發(fā)生，從而實現(xiàn)基因編輯。 本項成果構(gòu)建了適用于鹽單胞菌的基于CRISPR/Cas9的基因編輯系統(tǒng)。該系統(tǒng)由兩個載體組成：第一個載體表達Cas9基因，且不需要表達λ-RED重組酶，實際操作中不再需要誘導λ-RED重組酶的表達，簡化了步驟流程；第二個載體表達sgRNA，并含有用于同源重組的同源臂序列。從而實現(xiàn)了基因編輯。本項成果的技術(shù)優(yōu)勢包括： （1）基因編輯時間由原有的20余天縮短到7-8天； （2）N個基因編輯時間由原有的N個月縮短到3+5N天； （3）無需表達λ-RED重組酶。                        圖1 鹽單胞菌TD01進行基因編輯的流程示意圖02.應(yīng)用前景 本項成果可作為CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的載體，廣泛應(yīng)用于基因編輯領(lǐng)域。03.知識產(chǎn)權(quán) 本項成果已申請1項發(fā)明專利。04.團隊介紹 本項目為多團隊合作項目，其中一個團隊的負責人為清華大學教授，博士生導師，長江學者特聘教授，國家杰出青年基金獲得者。主要研究方向為合成生物學、微生物代謝工程、生物材料、工業(yè)生物技術(shù)。已發(fā)表國內(nèi)外高水平學術(shù)論文數(shù)十篇，申請專利70余項。05.合作方式 投融資。06.聯(lián)系方式郵箱：zhangxinrui@tsinghua.edu.cn

一種家蠶滯育品種的低溫催青轉(zhuǎn)基因方法。用特殊的催青條件改變家蠶滯育品種下一代蠶卵的化性,使 特殊的催青條件下獲得的當代家蠶滯育品種蠶蛾交配，產(chǎn)下非滯育的下一代蠶卵，最后參照非滯育家蠶卵胚 胎顯微注射的轉(zhuǎn)基因方法進行轉(zhuǎn)基因，從而巧妙地突破家蠶滯育品種轉(zhuǎn)基因技術(shù)的障礙并有效制作轉(zhuǎn)基因 蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的育種過 程，直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大量的人 力和物力。一種家蠶滯育品種的早期浸酸轉(zhuǎn)基因方法，利用在蠶卵胚胎發(fā)育至胚帶形成之前的一定時間內(nèi)， 即產(chǎn)卵后2個半小時之前對家蠶滯育卵進行鹽酸的浸泡處理,隨后對處理解除滯育的蠶卵進行風臺顯微注射， 催青孵化獲得的GO代家蠶的飼養(yǎng)至化蛾，它們的自交或回交產(chǎn)生G1代，通過熒光標記篩選，從而有效制作 轉(zhuǎn)基因家蠶。該方法直接采用生產(chǎn)中普遍使用的實用性家蠶滯育品種作為原始材料，可以避免漫長而煩瑣的 育種過程,直接利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)創(chuàng)造出各種性狀優(yōu)良的新的特殊家蠶品種，可大大縮短育種的周期，節(jié)約大 量的人力和物力。

1. 痛點問題 紅球菌是具有高抗逆性（耐有機溶劑、耐高溫、耐酸堿）的特殊放線菌，日本30年前首先使用紅球菌高效催化丙烯腈水合生產(chǎn)丙烯酰胺——其聚合產(chǎn)物廣泛用于石油開采、水處理、土壤改良劑等領(lǐng)域——迄今為止仍是工業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域最成功的案例之一。開發(fā)紅球菌基因編輯方法，一方面可以實現(xiàn)紅球菌細胞自身性能的按需調(diào)控（如敲除副產(chǎn)物基因），解決丙烯酰胺、丙烯酸銨等酰胺、羧酸類大宗/精細化學品生產(chǎn)中的高成本和高排放問題，另一方面有望以紅球菌細胞為普適性宿主，高表達各種外源功能酶，從而實現(xiàn)重組紅球菌全細胞催化技術(shù)的普遍應(yīng)用，尤其是解決手性醫(yī)藥中間體現(xiàn)有制備工藝中路線長、工藝復雜、原子經(jīng)濟性差、環(huán)境污染嚴重等各種主要問題。但是，作為一種革蘭氏陽性放線菌，紅色紅球菌存在基因組中GC含量高、基因轉(zhuǎn)化率低、非法重組嚴重等問題，基因組改造困難。目前紅色紅球菌基因組改造主要依賴于自殺質(zhì)粒介導的同源重組，但自殺質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率和單交換成功率很低，正確編輯率更低。因此，迫切需要開發(fā)高效的紅球菌基因組編輯工具。 2. 解決方案 本技術(shù)核心成果是一種基于CRISPR（成簇規(guī)律間隔短回文序列）-Cas9（DNA剪切蛋白）技術(shù)的紅色紅球菌基因組高效編輯方法。該技術(shù)通過紅色紅球菌特有啟動子及質(zhì)粒元件，首先實現(xiàn)了Cas9蛋白在紅色紅球菌中的表達及切割功能；其次成功規(guī)避了紅球菌的限制修飾系統(tǒng)，將紅色紅球菌基因轉(zhuǎn)化效率提高了80多倍；接下來，又通過紅球菌重組酶的引入，顯著提高了外源基因在紅色紅球菌中的同源重組效率，最終率先成功建立紅色紅球菌的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)，不僅可以實現(xiàn)基因組上目標基因的敲除、替換和改造，也可實現(xiàn)多個基因的同時敲除以及無痕疊加敲除，為紅球菌全細胞催化平臺技術(shù)開發(fā)及其在化學品綠色先進制造中的應(yīng)用奠定了堅實基礎(chǔ)。 合作需求 開展合作開發(fā)、技術(shù)許可等，尋求有志于生物制藥、生物合成、石油開采、日化洗滌等不同應(yīng)用領(lǐng)域進行紅球菌全細胞催化法生產(chǎn)目標產(chǎn)品的企業(yè)合作，尤其是在上述不同領(lǐng)域具有生產(chǎn)和銷售優(yōu)勢或經(jīng)驗的企業(yè)。

選擇標記轉(zhuǎn)基因作物已成為近年來植物基因工程技術(shù)研究的重點之一，隨著轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)品的商品化，轉(zhuǎn)基因植物的生物安全性受到公眾越來越多的關(guān)注，尤其是目前抗生素標記基因在植物遺傳轉(zhuǎn)化過程中的廣泛應(yīng)用，使人們對這些標記基因可能帶來的潛在危害性心存疑慮，抗性標記基因的存在嚴重地阻礙了轉(zhuǎn)基因植物的商品化進程和轉(zhuǎn)化技術(shù)本身的有效性。 本項目培育的無抗生素標記基因（可視化標記基因）在建立高效、安全、規(guī)模化的轉(zhuǎn)基因作物技術(shù)體系方面取得突破，以紫色幼芽作為可視篩選標記代替抗生素篩選標記，構(gòu)建了新型轉(zhuǎn)化載體

可以量產(chǎn)/n該項目屬于作物標記輔助育種技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用抗除草劑基因的油菜化學殺雄制種方法。本發(fā)明的特征包括培育耐受化學殺雄劑的父本材料和無遮擋的化學殺雄步驟。利用化學誘變劑誘變甘藍型油菜種子，在5-6葉期噴施除草劑苯磺隆，初步篩選得到抗除草劑的突變體材料，自交得到穩(wěn)定遺傳的抗除草劑油菜突變體株系，提取油菜突變體株系基因組DNA，擴增得到BnaAHAS1和BnaAHAS3基因片段，其中BnaAHAS3基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，在該基因BnaAHAS3第536bp處存在一個

中試階段/n該項目提供一種評價轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性的方法，包括如下步驟：轉(zhuǎn)基因稻田和非轉(zhuǎn)基因稻田布置和管理；稻田水層和淤泥中外源蛋白的測定，包括樣本預(yù)處理和外源蛋白的抽提和測定；稻田水層中浮游生物的分離，包括水樣采集、沉淀分離浮游生物；稻田水層中浮游生物種類和豐度的測定，包括活體鑒定和數(shù)量計數(shù)；轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻的種植對浮游生物的安全性評價，利用分析軟件對浮游生物種類、數(shù)量、發(fā)生時期進行統(tǒng)計分析，得出多樣性指數(shù)、均勻性指數(shù)等參數(shù)，并和常規(guī)稻田進行比較，從而對轉(zhuǎn)基因抗蟲水稻水生環(huán)境安全性進行評價。

可以量產(chǎn)/n由于香石竹是乙烯敏感植物，在其采后貯藏運輸期間需花費大量的人力物力進行保鮮處理。傳統(tǒng)的保鮮方法多采用含有乙稀抑制劑(如AVG、GVG、AOA)和乙稀拮抗劑(如AgNO3、STS、2,5-NBD)的保鮮劑，或是利用冷藏、氣調(diào)等措施，不僅成本高，效果也不盡人意，且易造成環(huán)境污染。本成果運用轉(zhuǎn)基因沉默理論，通過基因工程的方法抑制香石竹內(nèi)源乙烯的生物合成，從而達到延長香石竹自然保鮮期的目的，進而達到有效調(diào)節(jié)貯運和香石竹市場供應(yīng)之目的。技術(shù)水平：利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了瓶插壽命明顯延長的香石竹切花'M

研發(fā)階段/n基于基因組定點編輯分子育種新技術(shù)及其配套軟件。　　成果簡介：本成果含有完整的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)介導的基因組定點編輯技術(shù)，我們對基因組編輯技術(shù)切割活性和脫靶效應(yīng)進行了優(yōu)化，開發(fā)了完整的sgRNA設(shè)計，sgRNA表達載體構(gòu)建，細胞或在體水平基因組打靶和脫靶檢測等技術(shù)。提高基因組定點打靶效率和降低脫靶風險，為基因組定點編輯技術(shù)應(yīng)用于動植物分子育種打開了新的局面。本成果擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因組編輯技術(shù)配套軟件，其適用于針對不同物種基因組設(shè)計和篩選活性高，特異性強的sgRNA用于動植物分

全面開發(fā)了生脈散抑制 ras 原癌基因過表達中 的新用途，具體涉及在制備抑制 ras 原癌基因過表達的抗腫瘤藥物中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種檢測牛APAF1基因隱性致死突變的方法，涉及分子生物學領(lǐng)域，本發(fā)明方法基于焦磷酸測序技術(shù)，采用一對擴增引物、一條通用引物和一條測序引物，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.1、2、3、4所示，對牛5號染色體63150400bp位點的單核苷酸多態(tài)性進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)牛APAF1基因野生型純合子在C堿基處有峰，T堿基處無峰；而致死突變攜帶者在C堿基與T堿基處均有峰。本發(fā)明提供的方法操作簡單，靈敏度高，準確性強，通量高，檢測成本低，可快速檢測APAF1基因隱性致死突變攜帶者的個體，在牛的育種過程中具有重要應(yīng)用價值。