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（1）針對氧化還原酶在對映選擇性和催化活性等方面的適用局限性問題，建立分子改造與基因組挖掘技術(shù)平臺。通過理性設(shè)計(jì)改造野生型酶，改善和強(qiáng)化酶的催化特性與功能，獲得具有自主知識產(chǎn)權(quán)的高活性、高立體選擇性制備芳基手性醇的重組氧化還原酶及新基因，拓展了酶的適用性，并為進(jìn)一步認(rèn)識酶分子催化機(jī)制奠定基礎(chǔ)； （2）建立了高效穩(wěn)定全細(xì)胞催化的(S)-苯基乙二醇公斤級制備體系，在 100L 罐中，將底物濃度從 15 g/L 提高到 25 g/L，獲得了生產(chǎn)規(guī)模放大和產(chǎn)物的高效提取與精制等重要研究成果。產(chǎn)物光學(xué)純度和產(chǎn)率分別達(dá)到 99%和 93%。最終產(chǎn)物收率為 85%； （3）以數(shù)種手性醇酸化合物(R)-苯基乙二醇、(S)-間氯苯基乙二醇、(R)- 扁桃酸、(R)-2-辛醇為模型產(chǎn)物，通過生物催化劑篩選、理性設(shè)計(jì)催化過程、合理修飾底物和采用原位分離策略等，大大提高微生物不對稱還原潛手性化合物的效率，為手性化合物的制備提供了高效、安全的生物途徑。

項(xiàng)目成果/簡介:本發(fā)明提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對于揭示茶樹咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義.

中國科大陳宇星教授、周叢照教授和孫林峰教授課題組合作闡明了金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）胞壁酸（WTA）翻轉(zhuǎn)酶TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)WTA的機(jī)制和TarGH特異性抑制劑Targocil的抑制機(jī)制。該研究成果在線發(fā)表在微生物領(lǐng)域?qū)I(yè)雜志mBio上。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）是主要的臨床致病菌之一，其引發(fā)的感染難以治愈甚至可能致死。由于近年來抗生素濫用，出現(xiàn)了對所有的β-內(nèi)酰胺類藥物都具有抗性的MRSA菌株。研究表明S. aureus細(xì)胞壁主要成分WTA是引起耐藥性的關(guān)鍵因素之一。在革蘭氏陽性菌中，WTA是一類共價(jià)連接在肽聚糖上的陰離子多聚物。WTA在細(xì)菌分裂、生物膜形成、宿主定殖以及細(xì)菌感染等過程中起著重要作用。因此，WTA合成路徑中的關(guān)鍵酶是新型抗菌藥物的重要靶點(diǎn)。在S. aureus中，WTA合成前體是N-乙酰葡糖胺修飾的多聚核糖醇長鏈，其通過共價(jià)鍵連接在錨定在細(xì)胞膜上的脂質(zhì)載體Und-PP上。該Und-PP連接的多聚核糖醇長鏈前體先在細(xì)胞內(nèi)完成合成，最后通過ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TarGH翻轉(zhuǎn)出細(xì)胞膜。作為最具潛力的抗生素靶標(biāo)之一，TarGH及其抑制劑得到廣泛研究。先導(dǎo)化合物小分子Targocil是近期被鑒定出來特異性抑制TarGH效率較高的抑制劑，但是其抑制的分子機(jī)制并不清楚。為闡明TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)WTA的機(jī)理以及Targocil的抑制機(jī)制，作者用冷凍電鏡方法，解析了金黃色葡萄球菌WTA翻轉(zhuǎn)酶TarGH的同源蛋白，來自Alicyclobacillus herbarius菌的TarGH結(jié)構(gòu)。其同源性為50%。TarGH結(jié)構(gòu)總體分辨率為3.9 ?，其核心結(jié)構(gòu)區(qū)域分辨率達(dá)到3.6?。由于未結(jié)合ATP，TarGH結(jié)構(gòu)處于開口朝向細(xì)胞內(nèi)的構(gòu)象狀態(tài)。基于結(jié)構(gòu)，作者計(jì)算出了底物轉(zhuǎn)運(yùn)通道，通過對組成通道的氨基酸殘基性質(zhì)分析并結(jié)合生理實(shí)驗(yàn)，闡明了底物特異性識別機(jī)制。通過結(jié)構(gòu)比對作者提出TarGH及其同源蛋白利用“曲柄連桿”原理來實(shí)現(xiàn)底物轉(zhuǎn)運(yùn)的分子機(jī)制。具有類似結(jié)構(gòu)特點(diǎn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白都可以利用這一機(jī)制通過相對微小的總體構(gòu)象變化轉(zhuǎn)運(yùn)較大的底物。作者進(jìn)一步通過生化實(shí)驗(yàn)和計(jì)算機(jī)模擬確定了Targocil結(jié)合TarGH的精確位點(diǎn)，并闡明了其抑制TarGH轉(zhuǎn)運(yùn)胞壁酸的分子機(jī)制。

"磷脂酶 D （PLD）是一類具有水解作用和磷酰基轉(zhuǎn)移作用的酶, 在磷脂改性方面發(fā)揮著重要作用。它可以將大量磷脂酰膽堿(PC) 催化合成為自然界稀有的磷脂質(zhì)，如磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)和磷脂酰甘油(PG)等，合成的磷脂質(zhì)在醫(yī)藥和食品工業(yè)具有很大的應(yīng)用前景。但由于來源不足和價(jià)格高，PLD的工業(yè)應(yīng)用一直受到限制。本項(xiàng)目通過基因工程和微生物發(fā)酵技術(shù)，解決了PLD工業(yè)化應(yīng)用中難表達(dá)和表達(dá)量不足的難題，利用重組大腸桿菌發(fā)酵實(shí)現(xiàn)了PLD的高水平表達(dá)，其酶活為106 U?L-1，產(chǎn)量為748 mg?L-1，分別比目前報(bào)道的最高水平提高了100倍和20倍；同時(shí)，本項(xiàng)目還建立了一種簡單有效提取重組PLD的方法，可望大大降低PLD的生產(chǎn)成本。本技術(shù)先進(jìn)，應(yīng)用前景看好，如按106 U?L-1的發(fā)酵水平生產(chǎn)，成本約100元人民幣/1000 U，目前市場售價(jià)在3000-6000元/1000 U，利潤空間很大。 "

其他成果/n本發(fā)明屬于飼料添加劑技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種α-半乳糖苷酶軟膠囊飼料添加劑及其制備方法。該方法包括以下步驟：1)向磷酸鹽緩沖溶液中加入α-Gal，然后加入β-CD，再經(jīng)過均質(zhì)后靜置反應(yīng)，至反應(yīng)終點(diǎn)，得到α-Gal—β-CD添加液；2)將B型明膠加入水中，充分溶脹后加入甘油、防腐劑和二氧化鈦，混合均勻進(jìn)行膠化，得到膠料；3)灌裝。通過本發(fā)明得到的軟膠囊添加劑利用環(huán)糊精抑制劑對α-Gal的抑制作用，使動(dòng)物飼料中的α-Gal酶活，經(jīng)歷一個(gè)先低后高的過程，從而使飼料中的α-Gal在更合適的消化時(shí)期發(fā)揮催化作用。

本技術(shù)采用花生殼、小麥麩皮、大豆皮等農(nóng)副產(chǎn)物為原料制備 納米纖維素。首次采用生物酶結(jié)合超聲波技術(shù)以農(nóng)副產(chǎn)品為原材料制備納米級 膳食纖維，克服了目前酸法制備納米級膳食纖維污染重、周期長等缺點(diǎn)，建立 了一種高效、綠色、環(huán)保制備納米級膳食纖維的新方法；首次開發(fā)出納米級膳 食纖維及高纖維食品：包括面制品、淀粉制品、肉制品及功能性飲料制品等， 拓展了納米級膳食纖維的應(yīng)用范圍。本項(xiàng)目所開發(fā)的納米級膳食纖維功能性食 品，兼具優(yōu)良口感與保健功效，具有良好的市場前景，對建設(shè)資源節(jié)約型和環(huán) 境友好型社會(huì)具有重要的促進(jìn)作用。 生產(chǎn)條件及經(jīng)濟(jì)效益預(yù)測：納米膳食纖維素的初步市場估價(jià)為 15 萬元/噸。 項(xiàng)目投產(chǎn)后，年加工量 2000 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生產(chǎn)線，估算投資額為 8000 萬，可 產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益 2.55 億元，實(shí)現(xiàn)利稅 1.2 萬元。年加工量 1000 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生 產(chǎn)線，估算投資額為 4000 萬，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效益 1.275 億元，實(shí)現(xiàn)利稅 8400 萬 元；年加工量 500 噸的農(nóng)副產(chǎn)物生產(chǎn)線，估算投資額為 2000 萬，可產(chǎn)生經(jīng)濟(jì)效 益 6375 萬元，實(shí)現(xiàn)利稅 3200 萬元。

我國是世界上第一造紙大國，紙和紙板產(chǎn)量已超過全球總產(chǎn)量的25%。但我國木材資源匱乏，充分利用速生闊葉材資源、采用高效清潔制漿造紙技術(shù)是從根本上解決我國造紙工業(yè)面臨的資源與環(huán)境問題的有效途徑。陳嘉川教授領(lǐng)銜的科研團(tuán)隊(duì)在973計(jì)劃和國家科技支撐計(jì)劃等資助下，歷經(jīng)10余年，自主研究開發(fā)了酶促磨漿技術(shù)、酶促消潛技術(shù)、酶助漂白技術(shù)、酶精制紙漿技術(shù)等一系列制漿造紙酶催化綠色新技術(shù)，在降低磨漿能耗、消除有毒物污染、提升紙漿品質(zhì)、改善抄造性能和研發(fā)高檔紙基新材料等方面取得了突破，實(shí)現(xiàn)了國產(chǎn)木材資源的高效高值化利用。 先后在世界造紙十強(qiáng)企業(yè)山東晨鳴紙業(yè)集團(tuán)和國內(nèi)龍頭企業(yè)山東太陽紙業(yè)股份有限公司等20余家骨干企業(yè)推廣應(yīng)用，用生物酶催化技術(shù)生產(chǎn)出了優(yōu)質(zhì)木漿，并用于高級紙基材料的生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)了速生闊葉材的高效高值化利用，并產(chǎn)生了重大的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。過2012-2014三年時(shí)間累計(jì)實(shí)現(xiàn)新增銷售額130.1億元，利潤25.6億元。

本發(fā)明提供茶樹咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP及其在制備轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用.本發(fā)明以茶樹DNA為模板,用GenomeWalking方法克隆得到茶樹TCS基因啟動(dòng)子序列,然后利用Gateway技術(shù)構(gòu)建重組植物表達(dá)載體pKGWFS7TCSP,采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的煙草遺傳轉(zhuǎn)化,以表達(dá)GUS基因的方式進(jìn)行啟動(dòng)子活性功能驗(yàn)證.本發(fā)明首次從茶樹中克隆出特異性咖啡堿合成酶基因啟動(dòng)子TCSP,并驗(yàn)證了其活性,對于揭示茶樹咖啡堿合成的機(jī)理,生物調(diào)控茶樹咖啡堿的含量具有重要意義.

已有樣品/n一種抑制蘋果汁酶促褐變的加工方法。　　成果簡介：本成果克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種超聲波協(xié)同護(hù)色劑抑制蘋果汁酶促褐變的方法。本成果篩選出抑制酶促褐變的重要技術(shù)參數(shù)，對蘋果汁加工過程進(jìn)行優(yōu)化，以期為蘋果汁的褐變抑制提供新的方法。附帶地，本成果利用圓二色譜、熒光光譜、粒徑分析、電泳分析等分析技術(shù)對蘋果汁中引起褐變的關(guān)鍵酶——多酚氧化酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，并且對經(jīng)過超聲波協(xié)同護(hù)色劑處理后，多酚氧化酶的催化能力及結(jié)構(gòu)變化進(jìn)行研究，為蘋果汁加工中因酶促褐變引起色澤劣變，以及酶促褐變的抑制機(jī)理提供一定的理

高效的 多肽 - 多肽偶聯(lián)反應(yīng)對于 制備蛋白 - 藥物綴合物、調(diào)控蛋白質(zhì)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、生物成像 、化學(xué)生物學(xué) 等 領(lǐng)域 具有重要的意義 ，并因其可基因編碼的特性 而 備受關(guān)注 。目前， 研究 報(bào)道 此類連接方法 并不太多 見 ，其中 分選酶（ sortase ） 或 蝶豆粘酶 -1 （ butelase 1 ） 介導(dǎo)的偶聯(lián)反應(yīng)具有較好的底物 序列特異性 ， 內(nèi)含肽 （ intein ） 介導(dǎo)的蛋白質(zhì)連接方法 可實(shí)現(xiàn) 可基因編碼的高效主鏈連接， 而 轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶 （ transglutaminase ） 則 可以 介導(dǎo) 非特異性的 側(cè)鏈異肽鍵 偶聯(lián) 。近年來 ， 多肽 - 蛋白質(zhì)反應(yīng)對 的 蓬勃發(fā)展 為此類工具 的 發(fā)展 提供了新的契機(jī) 。 已 有 諜連接酶（ SpyLigase ）和探連接酶（ SnoopLigase ） 介導(dǎo) 的多肽 - 多肽偶聯(lián)體系 見諸報(bào)道 ，但其效率仍 有 待提高， 而 其 細(xì) 胞內(nèi)的應(yīng)用前景仍有待探索。 最近 ， 張文彬課題組發(fā)展了 獨(dú)特的具有無序結(jié)構(gòu)的 諜訂書機(jī) 酶 （ SpyStapler ），可實(shí)現(xiàn) 諜標(biāo)簽 （ SpyTag ）和北大 標(biāo)簽 （ BDTag ）在 細(xì) 胞內(nèi)和 細(xì) 胞外的高效偶聯(lián) （圖 1 ） 。