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本發明將裂解酶Bp7e氨基酸的第99位亮氨酸和102位蛋氨酸分別進行突變為丙氨酸和谷氨酸，經原核表達技術得到了突變體蛋白并經Western-blot對其進行了鑒定，命名為Bp7c突變體蛋白。對Bp7e和Bp7e突變體蛋白進行了純化及濃度測定，通過體外裂解實驗及裂解譜檢測得知，純化的Bp7e和Bp7e突變體兩種蛋白具有廣譜的抑菌作用，對溶壁微球菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和多種血清型大腸桿菌均有裂解效果，且Bp7e突變體裂解效果整體優于天然裂解酶Bp7e。

鑒定首個高階環加成酶，拓展了環加成酶的認知 一、項目分類 重大科學前沿創新 二、成果簡介 南京大學化學化工學院梁勇教授，生命科學學院譚仁祥教授和戈惠明教授的科研團隊，發現了抗幽門螺旋桿菌的潛在藥物-漢城霉素并對其生物合成途徑進行深入研究。通過多菌株基因組序列比對，對漢城霉素類生物合成基因簇進行了鑒定，利用微生物學，分子生物學、底物化學衍生化、體外酶促反應等手段從該基因簇中鑒定出一個新穎、可催化高階環加成反應的酶。團隊基于蛋白質晶體數據，量子化學計算和蛋白質定點突變技術，對該酶促動力學過程進行了深入解析，最終確定該酶通過“雙過渡態”來同時催化產生6+4和4+2環加成產物。該特殊高階環加成酶的發現，解答了“自然界中是否存在酶催化的高階環加成反應”，這一持續五十余年的謎題。這類酶的發現將進一步拓展人們對周環反應酶的認識，啟發科學家們將來利用和改造周環反應酶來實現有價值的分子轉化。 成果于2019年4月以Letter形式發表于Nature。F1000評述該研究“鑒定首個高階環加成酶，拓展了環加成酶的認知”，諾貝獎得主霍夫曼評述“這是在酶促反應中直接觀察到的[6+4]環加成產物的首個例子……，該研究對酶促高階環加成研究具有深遠影響”。

磷脂酶D（PLD,EC 3.1.4.4）是一類廣泛存在于各種生物體的酶，具有水解作用和磷?；D移作用（見圖1）。作為一種酶制劑，PLD的轉磷脂酰活性尤為重要，被用于制備具有生物活性的稀有磷脂。其中，以大豆磷脂酰膽堿（PC）為底物，PLD酶法制備磷脂酰絲氨酸（PS），受到廣泛關注。PS作為腦健康營養補充劑，相繼被美國FDA、日本HBM和中國國家衛生計生委所認證，列為新資源食品。相較于提取自牛腦和植物的PS，生物酶法制備的PS，避免了食品安全和植物源含量低的問題。進一步，一些新的結構和功能磷脂，通過PLD轉磷脂酰反應被合成出來，例如，磷脂酰鯊肝醇、磷脂酰葡萄糖、心磷脂類似物、磷脂酰酪醇、磷脂酰萜烯和磷脂酰絲氨醇，它們中一些具有抗癌和抗氧化活性。 直到現在，受限于磷脂酶D來源不足和價格高（鏈霉菌屬PLD，≥150 units/mg，6516.9¥/1000 U，Sigma公司），其工業上的廣泛應用受到限制。例如，文獻報道的PLD最高產量在104-105U·L-1，而制備轉化得到每公斤PS，需要2.6×106U的PLD。這一障礙的主要原因是高水平表達的PLD對宿主的嚴重細胞毒性，導致細胞死亡。 歷經5年時間，從上游到下游整體設計，我們解決了毒性蛋白（磷脂酶D，PLD）異源表達難的問題（質粒不穩定、蛋白合成時間短、細胞生長抑制和裂解），PLD生產達到目前世界最高水平106U·L-1(748 mg·L-1)（提高20倍）；同時發展一種簡單有效提取重組磷脂酶D的方法（無需破碎、無需添加溶菌酶和有機溶劑、室溫進行），PLD生產成本有望降低20倍以上。按照實驗室規模的一臺5 L發酵罐，年產量可以提供3.5×108U的磷脂酶D，滿足100 kg的PS轉化需求計算（不計算PLD重復利用率），擴大反應器體積至100-1000 L，PLD產量可滿足制備2-20噸PS的需求。

本發明提供一種巴斯德畢赤酵母、產生的耐高溫蛋白酶及應用，屬于微生物技術領域；本發明通過選育一種可產生耐高溫酶的巴斯德畢赤酵母(pichia pastoris)AN?PK?9K?GS115，然后將其進行培養，從發酵液中提取耐高溫蛋白酶，將其用于羽毛粉的水解，可以有效水解羽毛粉，將其中蛋白質組分高效降解為小肽成分或者氨基酸成分，從而提高蛋白質的消化率，增加采食量，提高動物健康水平。 （注：本項目發布于2019年）

本發明提供了一種固定化磷脂酶A1在制備磷脂DHA中的應用，具體過程為，六水硝酸鈷和2?甲基咪唑分別溶于無水甲醇得到六水硝酸鈷溶液和2?甲基咪唑溶液，將2?甲基咪唑溶液滴加至六水硝酸鈷溶液中，攪拌反應、靜置、干燥，得到ZIF?67納米材料，將ZIF?67納米材料于磷酸鈉緩沖液中混懸，加入磷脂酶A1溶液，調節pH，置于搖床孵育，離心、干燥，獲得ZIF?67納米材料固定化磷脂酶A1；將游離脂肪酸和大豆卵磷脂組成的底物和固定化磷脂酶A1在有機反應體系中進行催化反應，分離純化獲得磷脂DHA。固定化磷脂酶A1，穩定性好，催化制備磷脂DHA，DHA摻入率高達51.04%。

低分子量肝素(LMWH)是臨床上最主要的天然抗凝劑，目前主要是通過動物來源的肝素進行酶降解制得。歐洲藥典要求 LMWH 的分子量為 6000~8000，質量控制是生產 LMWH 的重要環節。而肝素酶的活性和利用率直接影響 LMWH 生產成本和產業經濟。 本項目組利用融合肝素酶 I (Hep I)與甲殼素之間的親和作用，實現酶的循環利用，同時融合酶活性和穩定性提高。利用綠色溶劑體系制備形態完好、尺寸均一的甲殼素微球。用固定化酶制備的 LMWH 產品達到歐洲藥典要求，實現了分子量可控，生產過程可實時監測。該項目將對 LMWH 產業的綠色和經濟生產提供技術支持。目前已發表 SCI 論文 2 篇，并與相關企業開展了合作。 

角蛋白酶是一種特異性蛋白酶類，可降解結構復雜、硬質難溶的角蛋白，具有多種優良的催化特性，在生物加工、綠色制藥、廢棄生物質處理、生物制革、生態紡織、洗滌劑等實際應用中備受關注，被認為是有著巨大應用潛力和市場前景的新一代蛋白酶類。 本項目從角蛋白酶基因挖掘、高效表達、性能改造及其應用研究等方面開展了一系列工作。課題組目前建立了角蛋白酶資源庫，是我國擁有角蛋白酶基因資源產權最多和最具多樣性來源的單位；實現了角蛋白酶基因在大腸桿菌及枯草芽孢桿菌等外源宿主中的克隆及高效表達；在 5L 罐上發酵酶活最高可達10000 U/mL 以上，是目前文獻報道的重組角蛋白酶表達最高水平；項目已完成了 1M3 規模中試試驗，成本降低 30%以上。在應用方面，本項目成功將角蛋白酶用于生物法制備納米銀粒子 AgNPs，與傳統化學法相比，酶法合成的納米銀具有更好的抑菌活性。另外，項目組已首次開發出無膠原活力的高特異性角蛋白酶，具有高角蛋白活力，不會對皮革膠原造成破壞，能保護膠原結構完整性，可開發出不傷及皮膚真皮的洗滌劑產品、藥品及化妝品，在生物制革領域也具有極大應用價值，可緩解制革工業中的爛皮現象；同時本研究所開發的角蛋白酶在活性多肽制備中也表現出良好的應用前景。

長期以來，山楂鮮食的疲軟和加工技術的薄弱與老化嚴重制約著山楂種植與加工產業的發展，針對此背景，本項目系統的研究了山楂果實的品質成分和營養功能特性，通過生物轉化技術開發出了新型天然食品添加劑、高品質凝膠食品、健康食品原料、山楂發酵飲料等系列產品，引領行業技術革命。主要體現為：    （1）山楂寡糖的生物加工及寡糖基天然食品防腐劑：項目首次發明了山楂寡糖連續大量生產的軸式-仿膜式生物反應器，穩定的生產出平均聚合度 5.4 的山楂寡糖；開發的寡糖基天然食品防腐劑在飲料、面制品和肉制品等食品上的保質保鮮效果顯著優于目前市售的化學合成防腐劑山梨酸鉀和天然食品防腐劑Nisin與那他霉素。    （2）山楂寡糖對脂質代謝的調節作用與機制：首次發現聚合度 5-8 的山楂寡糖具有顯著的抑制肥胖、改善脂質代謝紊亂和內臟脂肪蓄積的功能，并闡明了其通過 ADP/AMPK 和 ADP/ PPARα 信號通路的作用機制。作為健康食品原料/配料，在相關企業推廣應用中收到了良好的作用反饋效果和顯著的經濟效益。    （3）高品質糖制凝膠食品加工技術：首次系統的闡明了山楂果膠的化學構造和食品學性質，通過生物酶法修飾技術，提高了山楂果膠的凝膠性和粘彈性，在生產高品質山楂糖制凝膠類食品上取得了技術突破。    （4）山楂制汁及山楂酵素飲料生產技術：研發的中溫結合酸性微環境控制技術和純化的多聚半乳糖醛酸酶分解技術成功解決了目前山楂汁生產中存在的褐變和褪色等瓶頸問題，極大的降低了山楂汁中的甲醇含量。利用選育馴化的植物乳桿菌發酵山楂果汁，開發出了功能、營養和色香味俱佳的山楂飲料，填補了市場空白。    （5）主要成果及應用情況：經過項目的運行，授權發明專利 5 件，發表相關論文 60 余篇，其中 SCI 檢索 30 余篇，培養研究生 50 余人。項目技術和產品在相關企業進行了推廣應用，近三年累計直接經濟效益 3.52 億元。項目成果同時對遼寧省食品加工業和山楂種植與加工業的發展起到了積極的促進與推動作用，近年新增山楂種植面積 2 萬多畝，每年為遼寧省解決 10 萬多噸山楂的銷售出路，為果農增加收入 4 億多元，輻射經濟效益達 10 多億元，為社會提供了 300 多人的就業機會，經濟與社會效益顯著。

 課題組自2003 年開始圍繞藍莓深加工基礎理論和應用技術展開了深入系統地研究，取得多項技術突破，創立了我國藍莓深加工技術集成體系。針對此研究，課題組制定藍莓地方標準1 項，出版專著1 部，發表相關學術論文60 余篇（其中被SCI、EI 檢索21 篇），獲得授權發明專利7 項。主要技術內容如下：     （1）藍莓深加工基礎理論研究：首次發現藍莓花色苷對環磷酰胺（一種常規抗腫瘤藥物，但對心臟有很強毒副作用）致大鼠肝、心臟、肺的損傷具有預防保護作用；開展了花色苷抗氧化、抗疲勞、提高視力等機理方面的深入研究；對藍莓果渣及葉中多糖及黃酮成分進行提取、分離和生物活性鑒定，為藍莓綜合利用提供了堅實的理論基礎。     （2）藍莓深加工應用關鍵技術研究：針對國內43 個主栽品種的加工特性進行研究，首次建立了我國藍莓品種加工適應性評價體系；采用生物技術法提取花色苷，提取率顯著提高；通過微膠囊包埋和分子修飾提高藍莓花色苷的穩定性；依托藍莓果酒低溫控溫發酵技術、藍莓果脯低溫真空滲糖技術、藍莓膨化聯合干燥及制粉技術、藍莓速凍輕簡化技術裝備開發及藍莓果汁壓榨無氧真空破碎等多項技術開發了多個系列藍莓深加工新產品。     （3）藍莓貯藏保鮮技術研究：明確藍莓采后病害發生原因、衰老機理，找到最佳防治措施及貯藏條件。采用200-600mg/L 的納他霉素有效防治灰霉病；2首次利用外源水楊酸調控誘導采后果實，結合高CO2 沖擊處理和箱式氣調技術（5%O2+30%CO2）進行貯藏，貯藏效果顯著。形成了一整套以藍莓貯藏與深加工技術為核心的關鍵技術體系，有效地提高了藍莓加工產品的營養價值和商品價值。通過該技術體系實施，藍莓鮮果采后損失率降至10%以下；貯藏期由30d 延長至95d；花色苷提取率較傳統水提法提取率提高了49.35%；通過包埋及分子修飾，對光、熱穩定性提高33.7%；果脯完整率達到95%以上；果實出汁率提高5.3%；開發新產品12 個。     該成果在遼寧（沈陽、丹東、莊河、撫順）吉林、黑龍江、山東、江蘇、湖北、云南、江西等地企業開展推廣應用，累計為企業增加經濟效益31.96 億元。2015.3.27 科技日報針對本課題組在藍莓科研成果轉化方面進行了報道?，F在藍莓深加工示范項目區已經建設成為以觀光度假、科普教育、農產品深加工為一體的現代化農業莊園，體現了良好的生態效益。

近年來,中國玉米加工業呈現強勁發展之勢,過大的發展規模不僅引發了玉米本身價格的上漲,而且對玉米相關產業發展及國家糧食安全產生了負面效應.為促進玉米加工業健康有序地發展,應在保證國家糧食安全目標的前提下,對玉米加工業發展投模進行控制,實施玉米加工業向原料優勢區域集中的政策;科學合理地確定玉米加工業的產品結構:建立與玉米加工業相適應的玉米種植業結構,實施玉米產業化經營.